Optimización de una técnica de PCR convencional para la amplificación de la región LCR y el gen E6 del virus del papiloma humano tipo 16

Abstract

El cáncer de cuello uterino es el cuarto cáncer más frecuente en mujeres en el mundo y a nivel mundial, el VPH 16 se encuentra presente en aproximadamente el 60% de los casos. A la fecha, las variantes de VPH 16 se clasifican en 4 linajes y 16 sublinajes asociándose algunas variantes con severidad de lesión. La secuenciación de la región LCR y del gen E6 es utilizada para la clasificación de variantes. Por ello, el objetivo fue optimizar 2 PCRs convencionales para detectar la región LCR y una PCR para el gen E6. Para ello, se utilizaron muestras positivas para VPH 16, cebadores específicos para la región LCR y el gen E6. Se probaron las reacciones a diferentes temperaturas de anillamientos. La concentración de MgCl2, dNTP y cebadores fueron determinadas siguiendo las recomendaciones del fabricante de la enzima ADN polimerasa utilizada. Para la amplificación de la región LCR y el gen E6 del VPH 16, se observaron mejores resultados a una temperatura de anillamiento de 57°C y 50°C, respectivamente. La concentración de MgCl2 utilizada en ambas reacciones fue de 1,5mM, la de dNTP 0,2mM y la de cebadores 0,2uM. La optimización de la reacción de PCR permitirá obtener amplicones aptos para secuenciación, a fin de determinar las variantes génicas y posteriormente evaluar funcionalidad y actividad transcripcional que puedan estar relacionadas con la patogénesis cervical.

Cervical cancer is the fourth most common cancer in women in the world and worldwide HPV 16 is present in approximately 60% of cases. To date, HPV 16 variants are classified into 4 lineages and 16 sublineages, with some variants being associated with lesion severity. Sequencing of the LCR region and the E6 gene is used for variant classification. Therefore, the objective was to optimize two conventional PCRs to detect the LCR region and one PCR for the E6 gene. For this purpose, HPV 16 positive samples, specific primers for the LCR region and the E6 gene were used. The reactions were tested at different alignment temperatures. The concentration of MgCl2, dNTP, and primers was determined following the recommendations of the manufacturer of the DNA polymerase enzyme used. For amplification of the LCR region and the HPV 16 E6 gene, the best results were observed at an annealing temperature of 57°C and 50°C, respectively. The concentration of MgCl2 used in both reactions was 1.5mM, dNTP 0.2mM and primers 0.2uM. The present optimization will be used to sequence the amplified products to determine the variants and subsequently evaluate the functionality and transcriptional activity in order to relate it to cervical pathogenesis.